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皓奇星 | 细胞培养工艺优化之培养基篇
2019-12-01

原创作者:小欣


摘要:

继皓奇星高表达株细胞是怎么炼成的公众号发布之后,相信不少读者对如何构建细胞株有了一定的了解,一个优秀的细胞株能让培养工艺开发工作达到事半功倍的效果,为尽量减短项目的早期研发时间,通常可以使用平台化的工艺进行放大生产。那么作为我们工艺人来说,除了放大研究及生产外,如何通过工艺开发,让高表达细胞株的表达水平和产品质量能百尺竿头更进一步,是一项不小的挑战。

工艺开发工作千绪万端,每一个培养的细节都是开发需要考虑的因素,如培养基、补料、培养温度、搅拌转速、溶氧参数、pH参数等等,另外不同的培养方式,除传统的补料流加培养,近年来兴起的高密度接种、灌流培养等等,也是工艺开发的热点。纵观这些因素,培养基及补料的开发和优化,在整个工艺开发过程中至关重要,无论是传统的批次补料培养,还是灌流培养,培养基和补料对产品的产量和质量均有举足轻重的影响,实际上灌流培养工艺开发的前期基础是培养基的开发,否则从成本角度考虑几乎体现不出灌流的优势。本期皓奇星栏目将接力细胞株构建,从细胞生命规律的角度,一起学习培养基是如何发挥作用的。

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图1.CHO-GS克隆在不同培养基中培养的最终表达量

(克隆及培养基来源:hg8868皇冠国际生物)

1 培养基成分概述

细胞吸收营养物质,合成自身组成物质,最后进行增殖需要一定的物质基础,如水、无机盐等无机物和蛋白质、核酸、脂质、糖类等有机物,这些物质基础构成了细胞的结构基础,如细胞膜,细胞质,细胞器,细胞核等等。只要培养的是具有生长和增殖能力的细胞,就必须提供基本浓度的这些物质基础,而我们构建的CHO细胞作为生产工厂,显然需要添加更多的营养成分去支持目的产物的合成。培养基的成分非常复杂,主要包含氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物、油脂、激素、生长因子等等。各类成分的作用及添加情况见下表。

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2  能量代谢及能源物质

细胞的一切生命活动都离不开能量,其生长增殖和蛋白表达需要消耗大量的能量,有研究表明每个细胞的平均干重大概在400pg,其中50%以上成分为蛋白质,而蛋白质合成主要是氨基酸通过肽键连接而成,每一个肽键的合成需要消耗3个ATP能量,而氧化一分子葡萄糖最终才产生约30个ATP能量,可见细胞就合成自身蛋白需要消耗多少能量,而一个高表达细胞株Qp能达到50pg以上,即每个细胞每天表达50pg蛋白,占到自身总蛋白近1/4。

葡萄糖作为培养基中最主要的能源物质被细胞吸收利用。它首先通过质膜上的转运蛋白进入细胞,在胞质内经多个步骤被分解为丙酮酸,这个过程称为糖酵解,其中一部分丙酮酸进入线粒体被完全氧化为水和二氧化碳并产生能量的过程即为TCA循环,TCA循环是细胞产生能量的主要方式,在细胞快速生长阶段,大部分丙酮酸(约90%)是在乳酸脱氢酶的作用下生成乳酸并分泌到胞外,所以这个阶段会出现乳酸的积累,降低了葡萄糖的利用效率。除此之外,葡萄糖通过磷酸戊糖途径可产生磷酸核糖,磷酸核糖是合成核苷酸的重要原料。

谷氨酰胺是仅次于葡萄糖的第二大能源物质,谷氨酰胺除了用于合成细胞自身物质及目的蛋白外,大部分的谷氨酰胺被转化成谷氨酸,谷氨酸进一步转变成α酮戊二酸后进入TCA循环产生能量。需要注意的是GS系统的CHO细胞,由于转入了外源性的谷氨酰胺合成酶基因,所以不需要从外界获取谷氨酰胺,其表达的谷氨酰胺合成酶可将谷氨酸合成谷氨酰胺。

3  氨基酸代谢及氨基酸类添加成分

氨基酸是细胞合成蛋白的分子基础,包括结构功能蛋白和目的蛋白。氨基酸分为必须氨基酸和非必须氨基酸,非必须氨基酸可由哺乳动物细胞合成,必须氨基酸细胞不能自身合成,必须由外环境提供,在培养基开发过程中,由于目的产物表达水平较高,细胞自身合成非必须氨基酸的速率一旦跟不上目的蛋白的合成速率,则容易发生错配影响产物的表达,所以一般会添加所有约20种氨基酸。氨基酸浓度的优化是培养基开发中最重要的环节,其浓度的微小改变就能显著影响细胞的生长和蛋白的表达。当然,在重组细胞中,大部分氨基酸用于合成蛋白质,还有一部分氨基酸被用于合成其它物质,如核酸和脂类物质。

氨基酸的代谢由于有共同的结构特点,因此有很多共同之处,但不同的氨基酸由于结构上的差异,代谢有不同之处,主要代谢去向如下表统计。


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从上表能看出,由于大部分的氨基酸通过脱氨基作用产生相应的α酮酸和氨根离子,因此氨根的积累是细胞培养中不可忽略的因素。此外,某些氨基酸通过转氨基作用可以生成其它氨基酸,这些氨基酸既属于非必须氨基酸。需要注意的是,由于酪氨酸和半胱氨酸的难溶性问题,一般以碱溶液的方式进行补料添加,现在市场上已有一些易于溶解的替代品,如默克开发的磷酸酪氨酸二钠盐和L半胱氨酸硫酸钠盐。


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图2.能量及氨基酸代谢通路

(图片来源:Sara Pereira, Helene Faustrup Kildegaard, and Mikael Rørdam Andersen Impact of CHO Metabolism> Production: An Overview of Toxic and Inhibiting Metabolites and Nutrients)

4  维生素及其功能

细胞的一切生命活动离不开生物催化剂酶,维生素作为酶的结合剂,与酶结合后催化细胞的生理活动,如代谢,能量转移等等,培养细胞本身无法合成维生素,因此培养基中维生素是必须添加的一类物质,尤其是B族维生素,如硫胺素、核黄素、泛酸、吡哆醇、生物素、叶酸、氰钴胺素、肌醇和维生素C等。细胞培养过程中常用的维生素功能如下表所示。

有些培养基中会适量添加脂溶性维生素如生育酚,视黄醇或者添加维生素D的前体物质如胆固醇,尽管这些脂溶性维生素对细胞的生长有一定的影响,考虑其添加的复杂性及难溶性,一般不考虑优化这些成分。

5  无机盐及其对细胞的影响

细胞质基质作为细胞质溶胶填充于有形结构之间,化学组成主要包括水、无机盐,脂类、糖类、氨基酸、核苷酸、蛋白质等,为各种细胞器维持其正常结构和功能提供合适的离子环境及物质底物。所以合适的无机盐浓度是细胞维持渗透压及电位环境必须的。培养基中常见的无机盐包括钠、钾、镁、钙、氯离子、磷酸盐、硫酸盐、碳酸氢根等。其中钙离子在胞内信号转导中发挥着重要的作用。磷酸盐除了作为缓冲盐之外,也是是核苷酸、核酸与磷脂的组成成分之一。镁离子作为ATP的共轭离子,其在培养基中的添加浓度较高,通常是mM级别添加。需要注意的是有文献报道合适的钠钾浓度比是细胞维持正常生理活动的基础。

6  微量元素及其主要作用

微量元素也作为辅酶因子参与调节细胞的生理活动,在培养基开发的早期阶段,由于培养基配制使用水的纯度较低,其包含了一定程度的微量元素,现在由于配制水的纯度大幅度提升,使得微量元素的开发显得越发重要,培养基中常用的微量元素包括锌、铜、铁、锰、硒、钼等。

铁是铁硫蛋白、过氧化物酶及过氧化氢酶的重要组成部分,在气体运输、生物氧化和酶促反应中发挥重要的作用。一般铁离子以络合物的形式被细胞利用,游离的或无效的螯和铁对细胞可能产生毒性,另外培养基中的超氧自由基或维生素C等还原剂可将三价铁还原为二价铁。考虑转铁蛋白的来源及成本问题,现在普遍用柠檬酸铁氨作为铁源加入到培养基中。

锌是含锌金属酶的组成成分,它与蛋白的折叠相关,能与蛋白质的二硫键有效结合,影响蛋白的稳定性和活性,在RNA/DNA合成、mRNA稳定及细胞抗凋亡过程中起到了不可或缺的作用,锌离子同时还参与了谷胱甘肽和抗氧化酶如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活化,可保护细胞免受ROS的攻击。有文献报道锌离子浓度添加至25mg/L可以提高CHO蛋白的表达。需要注意的是,当在培养基受到氧化应激后,锌离子可能与培养基中的氧化物、过氧化物和硫化物形成沉淀物而流失,培养基中其它成分如EDTA也可能会因为螯和作用降低锌的利用率。

铜离子在培养基中以一价还原铜和二价氧化铜的平衡存在,它可以氧化培养基中其它成分如半胱氨酸和维生素C,可与胱氨酸形成螯合物沉淀而导致致细胞培养基中半胱氨酸和胱氨酸的损失。培养基中半胱氨酸缺失后可停止蛋白和谷胱甘肽的合成。另外,某些细胞系中,培养过程中从乳酸生成向乳酸消耗的切换需要一定浓度的铜离子存在。

7  脂质和脂质代谢

脂质是细胞膜的主要组成之一,细胞膜保证了细胞内环境的相对稳定,同时调节和选择相应物质进出细胞,是物质自由进出细胞的屏障,在物质运输和蛋白分泌过程中也起了很重要的作用。细胞膜组成十分复杂,主要含甘油磷脂、鞘磷脂、糖脂、胆固醇、蛋白质和碳水化合物等,其中甘油磷脂中以磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸含量最高,其合成的基本原料为甘油、脂肪酸、磷酸盐、胆碱、丝氨酸和肌醇等,而鞘磷脂的主要合成原料包括脂酰CoA和丝氨酸,此外还需要吡哆醛等辅酶的参与。所以培养基中需要添加胆碱、乙醇胺、肌醇等等这些原料成分。

脂肪酸和甘油主要由葡萄糖代谢转化而来,哺乳动物细胞因为不能合成9碳以上的不饱和键,在培养基中可以添加适量浓度的亚油酸和亚麻酸,或者花生四烯酸等,但考虑到这些物质的来源问题,及添加的复杂性,需谨慎开发。胆固醇作为细胞膜的基本结构成分之一,是决定细胞膜性质的一种重要成分,同时可以转化为脂溶性维生素D3的前体。

8  抗氧化物质

所有细胞在培养过程中均会发生氧化应激,产生氧化中间产物,在无血清培养基体系中因缺乏抗氧化物质而更明显,随着活性氧浓度的增加会产生超氧自由基和过氧化氢,这些分子会损伤脂类、蛋白和DNA使细胞受到伤害。细胞存在两类抗氧化系统,一类是酶抗氧化系统,包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶,另一类是非酶抗氧化体系,维生素C、维生素E、谷胱甘肽、硫辛酸、类胡萝卜素、微量元素铜、锌、硒等。在培养基设计的时候一方面需要使用抗氧化物质使细胞能有对抗氧化环境的能力,另一方面是减少培养基中不稳定成分被氧化的概率。

谷胱甘肽作为培养基中常添加的抗氧化物质,由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。在重组蛋白表达过程中,目的蛋白表达越多,细胞需要应对的氧化应激越显著,产生越多的氧化型谷胱甘肽,有文献报道氧化型谷胱甘肽的累积是细胞死亡的早期凋亡信号,是除了氨根和乳酸之外引起细胞凋亡的另一因素。


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图3.谷胱甘肽的合成及代谢

(图片来源:Sara Pereira, Helene Faustrup Kildegaard, and Mikael Rørdam Andersen Impact of CHO Metabolism> Production: An Overview of Toxic and Inhibiting Metabolites and Nutrients)

9   核苷类物质

细胞合成嘌呤和嘧啶核苷酸需要氨基酸作为原料,如嘌呤的合成需要甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺及一碳单位,嘧啶的合成需要天冬酰胺、谷氨酰胺及一碳单位,这是细胞合成核苷酸的其中一条途径,即从头合成途径,另一条是补救途径,即以现成的核苷和碱基为基础合成核苷酸。DHFR能将二氢叶酸还原为四氢叶酸,而四氢叶酸是核苷酸从头合成途径的一个关键底物,DHFR缺陷型细胞因此无法从头合成核苷酸,需在培养基中添加现成的核苷类物质如次黄嘌呤和胸苷才能存活。CHO-DHFR细胞的设计就是基于这个原理,通过外源性插入DHFR和目的基因,即可在无次黄嘌呤和胸苷的培养基中生长,同时添加DHFR抑制剂可增加DHFR和目的基因的拷贝数。一般核苷类物质占细胞干重的比例很低,不超过5%,且细胞自身能合成,所以培养基中的添加量很低或不添加。

10  生长因子

生长因子可促进细胞的生长和增殖,如胰岛素,能调节细胞的代谢过程,促进细胞对葡萄糖的吸收和利用,同时能促进脂肪酸和蛋白质的合成,一般培养基中会添加,但是考虑培养基成本,现在普遍寻求能替代的化合物。

11  其它成分

细胞培养理化环境除了提供合适的渗透压之外,还需要合适的粘度,培养基中常用的F68,是一类聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物,属非离子表面活性剂,具有洗涤和消泡功能,其聚氧乙烯的比例越大,则亲水性越强,细胞缓冲效果越好,洗涤活性也越强,而聚氧丙烯的比例越大则消泡能力越强,当然毒性也越大。培养基中添加1-2g/L浓度的泊洛沙姆在细胞抗剪切力方面有较好的效果,但缺点是容易形成泡沫。缓冲剂为培养基提供了稳定的pH范围,常见的缓冲剂包括碳酸盐,磷酸盐缓冲体系以及HEPES。硫酸葡聚糖作为抗结团剂也是培养基中常见的一种添加剂。

A high-throu细胞代谢错综复杂,涉及到的成分千千万万,如何使用有限的成分开发出优秀的培养基,是工艺人一直面临的难题之一。需要我们首先从科学的角度出发,了解细胞的基本生命规律,熟悉基本生命物质的来龙去脉,再是借鉴前期的研究成果,培养基发展的前世今生经历了多少代科学家的不懈努力,在此基础上精益求精,才能走的更远,最后需要借助现代化的分析检测技术,分析物质的消耗和产出,从化学计量角度去实现细胞产能的最大化和最优化。


参考文献:

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